该研究成果以“Parkin Maintains Robust Pacemaking in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived A9 Dopaminergic Neurons”为题在线发表于运动障碍疾病领域TOP期刊Movement Disorders（最新影响因子：9.698；中科院1区）。浙江大学医学院附属第二医院神经内科张宝荣教授和美国纽约州立大学冯简教授为文章共同通讯作者，浙江大学医学院附属第二医院神经内科浦佳丽副教授为文章第一作者。该工作得到美国纽约州卫生部门研究基金（NYSTEM C029556）及国家自然科学基金（81771216）的资助。

[Pu J, Lin L, Jiang H, Hu Z, Li H, Yan Z, Zhang B, Feng J. Parkin Maintains Robust Pacemaking in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived A9 Dopaminergic Neurons. Mov Disord. 2023 May 11. doi: 10.1002/mds.29434. Epub ahead of print. PMID: 37166002.]

帕金森病（PD）是常见老年神经退行性疾病，中脑黑质致密部（A9区）多巴胺（DA）能神经元退行性变是其核心病理特征。虽然大多数PD病例是散发性的，但越来越多的证据表明遗传因素在家族性PD乃至散发性病例中均发挥了重要作用。

PRKN是PD最常见的隐性致病基因，编码Parkin蛋白，Parkin是一种泛素E3连接酶，在调控DA能神经元氧化应激、提高DA递质传递等过程中发挥关键作用。中脑黑质致密部DA能神经元具有autonomic pacemaking（AP）特性，可自发发出2~10Hz动作电位，这些自发形成的AP在维持DA能神经元的正常功能中起着重要作用。

值得注意的是，Parkin突变的PD患者不同，parkin基因敲除的模式动物缺乏明显的PD表型，为此，浙江大学医学院附属第二医院神经内科张宝荣教授团队联合美国纽约州立大学冯简教授，通过建立携带Parkin基因突变的人源性A9区DA能神经元及其同遗传背景对照（isogenic）模型，探索Parkin基因缺陷与中脑DA能神经元功能障碍之间的因果关系。

本研究利用TALEN （转录激活样效应因子核酸酶）修复了PD患者来源iPSC的Parkin基因3号外显子缺失（图1）；以及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将PD相关的Parkin 3号外显子区A82E点突变靶向引入野生型iPSC中（图2），产生了两对Parkin基因致病性突变及其野生型对照模型，并定向分化为中脑A9区DA能神经元（图3），该建模方法可最大程度地去除不同个体遗传背景和环境因素造成的差异，大幅提高研究结果的有效性和准确性。

图1：利用TALEN技术修复人iPSC Parkin 3号外显子缺失

图2：使用 CRISPR/Cas9将Parkin A82E突变靶向引入健康受试者的iPSC中

图3：将Parkin缺陷及其isogenic对照iPSC定向分化为A9区DA能神经元

在上述两对Parkin突变及isogenic对照DA能神经元中，我们利用全细胞电压钳技术进行长达110至140天的电生理记录，记录诱导的DA能神经元的自发性慢波自主同步起博放电情况。结果发现，相较于isogenic对照，Parkin 3号外显子缺失修复显著提高A9区DA能神经元APs的发放频率；同时，引入Parkin A82E点突变的A9区DA能神经元的APs电活动受到明显抑制（图4）。

图4：Parkin突变可致DA能神经元自发起搏动作电位频率显著降低

总结，该研究成功构建了两对具有或不具有携带Parkin基因突变的人源性A9区DA能神经元及其isogenic细胞模型。向正常神经元中引入Parkin突变时，DA能神经元的APs频率受到显著抑制；当Parkin突变被修复时，DA能神经元的APs频率显着增加（图5）。结果表明，Parkin对维持正常DA能神经元autonomic pacemaking是必要且充分的。

图5：揭示Parkin变异与DA能神经元自发同步起搏放电减少密切相关